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FISH 探針

發布時間:2017-04-22

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珂臻品牌FISH探針源于美國弗羅里達大學科研團隊,用于腫瘤分子診斷科研, 可以檢測如ALK, Her, c-MET、 8 /7/ 17號 染色體 等等。

FISH(fluorescence in situ hybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的,二者經變性-退火-復性,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。

簡介

FISH技術:熒光標記的原位雜交技術

1974年Evans首次將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合應用,提高了定位的準確性。20世紀70年代后期人們開始探討熒光標記的原位雜交,即FISH技術。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上,標志著染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代,隨著人類基因組計劃的進行,由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要,FISH技術得到了迅速的發展和廣泛應用。

原理

將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應,經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

實驗流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→染色體顯帶熒光顯微鏡檢測→結果分析。

特點

原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在于對制備樣品的要求不高,可以通過延長曝光時間加強信號強度,故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統則可克服這些不足,這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系,具有以下優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全;2、探針穩定,一次標記后可在兩年內使用;3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列,其靈敏度與放射性探針相當;5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

缺點:不能達到100%雜交,特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

應用

該技術不但可用于已知基因或序列的染色體定位,而且也可用于未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。

熒光原位雜交(FISH)技術的發展和進步

FISH技術顯示核酸是在同位素標記探針的基礎上改進而來的。早期的同位素標記沒有專門的標記方法,如將隨機同位素標記的堿基添加到生長的細胞中之后再進行放射自顯影。同位素雜交的諸多缺點必然要求用更好的技術來取而代之。首先,放射性材料決定了探針的不穩定性,特別是半衰期較短的同位素隨著時間推移不斷衰退而造成探針的活性不能持久。其次,雖然放射顯影的靈敏度極高,但是分辨率(清晰度)有限。第三,為了在放射顯影底片上獲得可檢測到的信號往往需要延長曝光時間,使檢測周期變長。第四,放射性標記探針相對比較昂貴,并且必須按照嚴格的程序轉運、貯存、處理帶有放射性的材料。而FISH 技術在分辨率、檢測周期、安全性等方面明顯得到了改進,并為以后的多位點檢測、高質量分析、活細胞繪圖等打下了基礎。

1980 年,Bauman 首次將熒光原位雜交用于核酸檢測,直接將RNA-3’端用熒光素標記作為特異DNA 序列的探針 。嵌入整個探針的酶結合熒光素標記堿基方法已經廣泛用于熒光探針的制備;一次可以標記一種顏色。氨基-烯丙基標記堿基技術可以與任何半抗原或者熒光素結合,這對于原位雜交是至關重要的,因為氨基-烯丙基標記的堿基技術可以僅通過簡單的化學反應就可以獲得一系列的低背景信號探針,通過雜交探針的二級檢測系統使得雜交信號被放大。早在19 世紀80 年代,缺口平移法檢測、生物素標記探針,二級熒光標記抗體檢測等方法已經用于DNA 和mRNA檢測。約十年后,單鏈DNA 探針的合成、標記方法的不斷改進可以使合成的雜交探針攜帶大量的熒光素分子用于直接檢測。在這些方法基礎上,有許多關于不同的檢測范圍、特異性,靈敏度以及分辨率等直接的或間接的改進技術方面的報道。

1 FISH 技術檢測位點數目及檢測目標的發展

在FISH 技術基本確立之后,FISH 不僅用于單基因或核酸檢測,FISH 技術的進一步發展擴展到多色FISH 多基因位點同時檢測,從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞轉錄產物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測,并且在今后的研究中還有可能應用到整個生物體的檢測。早期的探針較大,是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和隨機引物DNA 合成法來制備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重復序列造成高熒光背景,采用未標記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用于抑制非特異性雜交可以克服上述問題,同時也使得研究者擴大了檢測目標,實現了整條染色體染色。在細胞遺傳學上FISH 技術在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交(Comparativegenomic hybridization)用于檢測染色體區域的缺失和重復。大片段探針一旦和樣品非特異性結合就會形成一個信號,混淆染色體上基因的檢測,就需要剪切成小片段<200核苷酸?,F在檢測手段的提高以及檢測軟件的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低,靈敏度越來越高。精確的計算機圖片處理算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。隨著檢測目標越來越小,FISH技術已用于隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。

FISH 檢測范圍的擴大,使得FISH 技術的應用在20 世紀90 年代急速增長。由FISH 技術應用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。首先是采用不同的熒光素來檢測多位點,如雙色熒光用于檢測特異的核酸序列,每一條染色體、基因或者轉錄產物分別由一種可以分辨的熒光信號來表示。之后是采用兩種色彩譯碼方案進一步擴大了FISH 應用范圍。譯碼方案主要是針對色彩比例,即每一種顏色在總顏色中所占的比例來描繪多位點。前述的每一種方法,或是兩種方法的結合都已經將可檢測位點多達12 個。采用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表著FISH 技術多位點檢測的里程碑。盡管可以采用多種方法觀測到mRNAs,但是FISH 對整個轉錄產物的原位分析似乎更有應用前景。色彩譯碼技術已經實現了對整個組織的檢測。

2 FISH 技術的定量分析階段

Pinkel 等(1986)首次將熒光圖像定量分析用于基本細胞遺傳檢測,采用雙色激發塊裝置照相機檢測熒光信號,而且定量分析技術很快用于了mRNA 檢測。熒光檢測的關鍵是信號的重現性、無規律性及背景的自發熒光。不僅不同的樣品之間熒光不同,而且同一載玻片上的材料或者同樣的細胞都有可能顯示出不均衡的熒光。目前已有多種方法用于消除一些組織中的自發熒光:如樣品制備過程中,采用的消除自發熒光試劑包括硼氫化鈉或者采用光照輻射進行預處理以消除非特異性背景信號。這些消除自發熒光的方法并不完全有效,通常在進行圖像分析時通過計算機算術除去自發熒光信號。熒光圖像的光譜數據包括真正的信號和許多雜噪,分別進行分析并且通過單獨的光譜組分分析除掉雜噪數據。多色FISH 有自身的限制,包括不同的熒光強度和顏色重疊。但是通過計算機算法分析平衡了多色圖像,包括強度變化和自動糾正信號重疊。

FISH圖像自身的限制并沒有影響到自動破譯算法的發展。采用序列較大探針進行DNA 位點檢測和多色熒光計數算法輔助病理學家實現了自動化分析。此外,檢測探針試劑盒和點計數方法的應用為便捷的檢測結果提供了一個平臺。盡管多種方法已經用于分析或優化自動細胞檢測系統,人工的細胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。然而,細胞制備、鑒別、固定介質上細胞樣品計算機化檢測在未來的醫學診斷中的高效益性不容忽視,快速檢測細胞內的分子信號只有通過計算機輔助方法進行檢測?,F在,自動化檢測程序已經擴展到采用多基因轉錄模型檢測特異的DNA 簇和轉錄位點以確定功能細胞的狀態。

鑒于FISH 起始階段的發展主要是探針類型和檢測位點的擴展,熒光檢測技術將來的發展可能包括檢測領域的擴展。熒光圖像臨床診斷應用需要在檢測體系上進一步提高,如探針的結合,照相和分析的自動化,因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。近來的激光共聚焦顯微鏡和光學X射線斷層攝影技術要求樣品厚度達到1~2mm。一種改進的光學投射X 顯微斷層攝影技術可以獲取到15mm 厚樣品的圖像擴大了生物學和診斷樣品的檢測范圍?;罴毎腞NAs FISH 技術檢測也有報道。既可以采用體內釋放的熒光集團也可以采用雜交后探針的熒光素進行檢測。這兩種新方法都可以降低非特異性標記探針存在時的高背景(如活細胞),可以用于追蹤mRNA 的合成和轉移途徑。這些方法較綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)更易于檢測不同靶分子。相對于GFP 活細胞原位雜交檢測,FISH 易受到細胞內合成探針的影響。FISH 需要進一步的改進以降低活體基因表達檢測時的干擾背景,避免細胞內自身雜交物的干擾。其實完全可以不必考慮FISH 檢測和熒光檢測蛋白技術的差異,將FISH 技術和熒光蛋白技術結合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。

多光子顯微技術的應用進一步擴大了熒光圖像的應用范圍。采用多光子顯微鏡,激光塊可以發射光子聚焦于顯微鏡兩到三次激發目的熒光素。采用近紅外激發光可以更深層次穿透生物樣品,比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的應用已將熒光圖像用于活體系統的檢測,甚至整個動物體。由于還不能合成生物體標記探針,因此目前生物體內熒光圖像的應用只限于檢測熒光分子或生物體自發熒光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中產生的自發熒光信號可以作為一種重要的診斷信號。一旦生物體探針成為可能,將會成為鑒別特異核酸序列,進行非入侵診斷,獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。